| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 738-1 | ||||
Resumo:O gênero Bacillus, até recentemente, era composto por mais de 280 espécies válidas. Em 2020, 17 clados de Bacillus foram reclassificados em novos gêneros da família Bacillaceae, ficando Bacillus restrito aos clados Subtilis e Cereus. Bacillus e alguns destes gêneros correlatos contêm espécies de importância econômica na agricultura, indústria e medicina, o que torna essencial a busca de ferramentas que possibilitem a identificação taxonômica rápida, acurada e de baixo custo de suas linhagens. Neste cenário, o sequenciamento de genomas mostra-se inviável por ser oneroso e mais demorado. O marcador 16S não possibilita a delimitação de espécies dentro dos clados de Bacillus ou dentro dos gêneros relacionados. O marcador da girase B é utilizado para separação de espécies em diversos grupos taxonômicos de bactérias, porém, a dificuldade de amplificação e o uso reduzido dentro de grupos específicos limitaram a implementação deste marcador de forma ampla. Neste trabalho sugerimos o uso do marcador da girase B para identificação taxonômica de linhagens dos clados Cereus e Subtilis e de gêneros correlatos, suportado pelo desenvolvimento de um par de primers que possibilita amplificação robusta. Para o desenho dos primers, as sequências da girase B das linhagens Tipo de todas as espécies de Bacillus, Priestia e Nialia foram recuperadas dos genomas presentes no banco dados Genbank e alinhadas. A partir deste alinhamento foi feita uma escolha dirigida das regiões mais conservadas. O programa Primer3 permitiu identificar potencias pares de primers e suas características para o programa de amplificação. Para avaliar a eficiência de amplificação dos primers, o DNA genômico de linhagens de Bacillus e de gêneros próximos foi extraído e o gene da girase B foi amplificado por PCR utilizando o kit Taq DNA Polymerase (invitrogen) em termociclador MiniAmp (Applied Biosystems). Os fragmentos foram purificados utilizando mini-colunas (GFX, GE Healthcare) e sequenciados em sequenciador automático ABI 3500 XL (Life Technologies) utilizando o kit Big Dye (Applied Biosystems). A sequência consenso foi obtida com auxílio do programa Bioedit. Para a identificação taxonômica baseada no gene da girase B, os consensus foram alinhados com as sequências das linhagens Tipo mais próximas utilizando o programa CLUSTAL X. Árvores filogenéticas baseadas nos métodos de máxima verossimilhança e bayesiana foram geradas com o auxílio do programa Mega11 e do site Phylogeny.fr. Árvores filogenômicas de máxima verossimilhança foram construídas utilizando o programa GtoTree com os marcadores de cópia única do grupo Bacteria. Utilizando os primers desenhados, TVG1F e TVG1R, fragmentos com 1155 pares de bases da girase B foram amplificados e sequenciados com sucesso para 86 linhagens dos gêneros Bacillus, Priestia, Nialia e Robertmurraya, resultando na identificação destas em 20 diferentes espécies. A identificação taxonômica de 12 linhagens baseada na girase B com os primers TVG1F e TVG1R foi comparada àquela baseada em filogenômica e os resultados foram altamente congruentes. A amplificação e sequenciamento com eficiência dentro dos gêneros e a acurácia na identificação taxonômica obtida com marcador da girase B utilizando os novos primers indicam que estes podem representar um método fácil, rápido e de baixo custo para identificação de linhagens do gênero Bacillus e correlatos. Palavras-chave: Identificação taxonômica, Bacillus, girase B, filogenia, filogenômica | |||||